scRNA-seq 单细胞常规流程

一句话：从各种格式的原始矩阵进，到注释好的 Seurat 对象出——QC、Harmony 整合、聚类、UMAP、marker、SingleR 注释一条龙，每个阶段自动存 checkpoint 支持断点续跑。

获取本技能 · Get this skill

方式 A —— 一键引导 prompt（推荐）。复制下面这段，粘贴到你的 AI agent IDE：

请帮我安装 Claw2Bio 技能库中的 "scRNA-seq" 技能：
1. 从 GitHub 仓库 https://github.com/claw2bio/claw2bio 只拉取 bioinformatics/sc_RNA_seq/scRNA-seq
   这一个文件夹（用 sparse checkout，不要克隆整库）。
2. 阅读其中的 SKILL.md 并注册该技能。
3. 运行 examples/ 里的示例验证环境，把输出的图给我看。

方式 B —— 独立 zip 包（约 28 MB，本站下载）：https://claw2bio.site/downloads/scRNA-seq.zip

方式 C —— 全量示例数据（约 105 MB，腾讯 COS 直链）：https://my-website-1358159656.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/scRNA-seq/data/scRNA-seq-examples.zip

它能做什么

输入一个目录（10X mtx / h5 / h5ad / rds / 文本矩阵 / 华大 BGI / 多样本混杂均可，stage 00.5 自动体检并修复 9 类格式坑），输出注释好的 annotated_seurat.rds 与全套 QC、聚类、marker、注释图表。内置示例是降采样的 GSE234527（5 个样本 × 400 细胞）：QC 后保留 1820 个细胞（各样本保留率 93.8%–98.2%），聚成 9 个 cluster；多样本默认 Harmony 整合并输出整合前后对照 UMAP。

QC 后小提琴图

QC 后每个样本的 nFeature / nCount / percent.mt 分布（示例 1820 细胞，QC 阈值 percent.mt ≤ 20%）。

按注释着色的 UMAP

按 cell_type_final 着色的 UMAP——SingleR 自动注释结果（支持手动注释 CSV 一键回写，优先级高于 SingleR）。

按分组着色的 UMAP

按样本分组着色的 UMAP，用于检查组间分布与批次混杂。

marker 点图

每个 cluster 的 top-5 marker 点图（presto 加速的 wilcoxauc 检验）。

marker 热图

top-5 marker 表达热图，用于人工核对 cluster 身份。

本流程只到自动注释为止——拟时序、虚拟敲除是独立技能，都吃本流程的 annotated_seurat.rds。

快速上手（30 秒）

技能装好后，直接对 agent 说：

运行 scRNA-seq 的示例，把 UMAP 给我看。

或手动执行：

bash

cd bioinformatics/sc_RNA_seq/scRNA-seq
pip install pandas numpy scipy
python scripts/run_scrnaseq.py \
  examples/1_example_GSE234527_downsampled-10x-mtx/input \
  examples/1_example_GSE234527_downsampled-10x-mtx/output \
  --metadata examples/1_example_GSE234527_downsampled-10x-mtx/input/sample_metadata.csv \
  --overwrite

需要 R（≥4.5）及 Seurat / harmony / SingleR 等包；stage 00 会先检查依赖，缺包可加 --install-deps 让 agent 代装。

输入格式

单个 10X 目录、一目录的多样本文件，或上述 9 类格式的任意混合；输入永不被修改（解包/导出都进 <output>/.staging/）。
可选 sample_metadata.csv：两列 sample,group（样本名模糊匹配，容忍 GSM 前缀与 .tar 后缀）；不提供则进入单样本探索模式。

输出文件

文件	内容
`annotated_seurat.rds`	核心交付物：QC 后、聚类、注释的 Seurat v5 对象
`markers_all.csv` / `top10_markers.csv`	每个 cluster 的 marker 表（presto wilcoxauc）
`annotation_per_cluster.csv`	各参考注释对照 + `refs_agree` 一致性标记
`QC_violin_before/after.png`	QC 前后小提琴图
`UMAP_by_` / `TSNE_by_`	按 cluster / 样本 / 分组着色的降维图
`UMAP_before/after_integration.*`	Harmony 整合前后对照（多样本时）
`marker_heatmap.` / `marker_dotplot.`	top-5 marker 热图与点图
`REPORT.md` / `run_metadata.json`	人类可读报告 + 机器可读运行记录
`.checkpoints/`	每阶段 rds，供 `--resume` 断点续跑

参数

参数	默认值	说明
`--metadata`	—	`sample,group` CSV（缺省 → 探索模式）
`--organism`	`human`	`human` / `mouse`
`--integrate`	`harmony`	`harmony` / `cca` / `rpca` / `none`（仅多样本）
`--mt-max`	20	percent.mt 阈值（%）
`--min-features` / `--max-features-qc`	200 / 6000	nFeature 上下界
`--no-doublets`	关	跳过 scDblFinder 双细胞检测
`--resolution`	0.5	聚类分辨率（参考 `clustree_resolution_scan.png`）
`--downsample N`	0	每样本抽样 N 个细胞（大样本探索用）
`--resume`	关	跳过已完成阶段
`--overwrite`	关	允许非空输出目录

常见问题

跑到一半爆内存 → 这是常态（合并/整合是内存高峰）：直接加 --resume 重跑，已完成阶段不会重复；大样本先 --downsample。
UMAP 上批次分层明显 → 确认走了 Harmony（多样本默认开），查看 UMAP_before/after_integration 对照图。
percent.mt 全为 0 → 线粒体前缀会被自动嗅探；识别失败时用 --mt-pattern "^MT-" 手动指定。
想手动注释 → 把 top10_markers.csv 改成两列 cluster,cell_type CSV，跑 Rscript scripts/apply_manual_annotation.R <rds> <csv> <outdir>（REPORT.md 里有同样指引）。
h5ad 输入报错 → 需要 pip install anndata。

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