bulk RNA-seq 差异分析（counts → DEG）

一句话：counts 矩阵 + 分组表进，差异表达全套出——输入体检自动修复格式坑，按数据自动选择 DESeq2 / edgeR+voom / limma 引擎并打印理由。

获取本技能 · Get this skill

方式 A —— 一键引导 prompt（推荐）。复制下面这段，粘贴到你的 AI agent IDE：

请帮我安装 Claw2Bio 技能库中的 "bulk-RNA-seq" 技能：
1. 从 GitHub 仓库 https://github.com/claw2bio/claw2bio 只拉取 bioinformatics/bulk_RNA_seq/bulk-RNA-seq
   这一个文件夹（用 sparse checkout，不要克隆整库）。
2. 阅读其中的 SKILL.md 并注册该技能。
3. 运行 examples/ 里的示例验证环境，把输出的图给我看。

方式 B —— 独立 zip 包（约 76 MB，腾讯 COS 直链）：https://my-website-1358159656.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/bulk-RNA-seq/zip/bulk-RNA-seq.zip

方式 C —— 全量示例数据（约 87 MB，腾讯 COS 直链）：https://my-website-1358159656.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/bulk-RNA-seq/data/bulk-RNA-seq-examples.zip

它能做什么

输入基因 × 样本的 counts 矩阵和样本分组表，stage 00.5 输入体检自动修复混合矩阵 / GEO series_matrix 表头 / 转置 / 毁名 / 重复 symbol 等常见坑，然后按数据自动分叉引擎（理由强制打印）：

输入诊断	引擎
非整数 / 已归一化（FPKM、TPM、log）	limma-trend
整数 counts，最小组 n < 8	DESeq2
整数 counts，最小组 n ≥ 8	edgeR + limma-voom
声明 --paired-by（以上任意）	强制 limma + duplicateCorrelation
任一组 n = 1	探索模式：limma-trend 只算 fold change，REPORT 显著警告

内置示例为 GSE270189（小鼠前列腺基底细胞，3 组 × 2 重复），自动走 DESeq2 分支，输出 QC、每个 contrast 的 DEG 表、火山图、MA 图和 DEG 热图：

样本 PCA——检查组间分离与离群样本（离群只标记，绝不自动剔除）。

样本间表达相关性热图，批次效应在此一览无余。

每个 contrast 一张火山图，top-10 基因自动标注（默认阈值 padj < 0.05 且 |log2FC| ≥ 1）。

MA 图——检查归一化是否成功、logFC 与表达量是否脱钩。

显著 DEG 并集的 z-score 热图。

本流程只到 DEG 为止——富集分析、指定基因柱状图、GSEA 是三个独立技能，都吃本流程的产出。

快速上手（30 秒）

技能装好后，直接对 agent 说：

运行 bulk-RNA-seq 的示例，把火山图给我看。

或手动执行：

cd bioinformatics/bulk_RNA_seq/bulk-RNA-seq
pip install pandas numpy
python scripts/run_rnaseq.py \
  examples/1_example_GSE270189_clean-mouse-3groups/input/counts_matrix.csv \
  examples/1_example_GSE270189_clean-mouse-3groups/input/sample_metadata.csv \
  examples/1_example_GSE270189_clean-mouse-3groups/output \
  --control Control --organism mouse --overwrite

需要 R（≥4.3）及 DESeq2 / edgeR / limma / OrgDb 等包；stage 00 先查依赖，缺包可加 --install-deps 让 agent 代装。

输入格式

counts_matrix.csv——基因行 × 样本列的原始整数 counts（归一化矩阵也收，自动走 limma-trend；csv/tsv/txt 及 .gz 均可，分隔符与压缩自动识别）：

,CJI1.A,CJI2.B,CJI3.I
ENSMUSG00000000001,2014,2003,2847
ENSMUSG00000000003,13736,19194,...

sample_metadata.csv——必需列 sample,group；可选 batch / 个体列配合 --batch / --paired-by：

sample,group,subject
S1_pre,pre,Subject1
S1_post,post,Subject1

第一个 group 默认为对照，除非 --control 指定；非标准列名自动归一化。

输出文件

文件	内容
DEG_<treat>_vs_<ref>.csv	每个 contrast 的完整 DEG 表（Ensembl 已转成 Symbol）
Volcano_<treat>_vs_<ref>.png/pdf	火山图（top-10 基因标注）
MA_<treat>_vs_<ref>.png/pdf	MA 图
DEG_heatmap.png/pdf	显著 DEG 并集 z-score 热图
QC_PCA_plot.* / QC_sample_correlation_heatmap.* / QC_summary.txt	QC 三件套
normalized_expression.csv	归一化矩阵（供 RNA-seq-gene-plot 使用）
cleaned_counts.csv / cleaned_metadata.csv	仅当输入被修复时输出（原文件不动）
REPORT.md / run_metadata.json	产出说明报告 + 机器可读运行记录

参数

参数	默认值	说明
--control	metadata 第一个组	对照组名
--engine	auto	强制 deseq2 / edger-limma / limma
--voom-min-n	8	voom 分支的最小组样本数阈值
--organism	mouse	mouse / human / rat OrgDb 快捷方式
--orgdb / --gene-map	—	任意 OrgDb 包 / 两列 ID 转换 CSV
--batch	—	批次列（进 design 公式 + QC 着色）
--paired-by	—	个体列（强制 limma + duplicateCorrelation）
--contrasts	—	显式 contrast，如 'A vs B, C vs D'
--padj / --log2fc	0.05 / 1	显著性阈值
--exclude-samples	—	显式剔除样本（绝不自动）
--overwrite	关	允许非空输出目录

常见问题

• 数据是 FPKM 怎么办 → 直接给，自动走 limma-trend 并打印理由；无需自己转换。
• 有批次效应 → metadata 加一列批次，跑时加 --batch <列名>。
• 配对样本 / 重复测量 → 加 --paired-by <个体列>，自动强制 limma + duplicateCorrelation。
• OrgDb 包装不上 → 可用预编译压缩包（Download 页 COS 镜像），或 --gene-map 两列 CSV 免 OrgDb；resources/r-deps/ 还有 139 个 Windows 二进制包的离线小仓库。
• 输入文件被改了吗 → 没有，修复后的副本写入输出目录，原件不动。

相关链接

• GitHub 源码与 SKILL.md
• 相关技能：富集分析 · 指定基因柱状图 · GSEA